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hplc原理及操作，hplc這個很多人還不知道,現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！

1、原理：儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運(yùn)動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別。

2、被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)就可以以圖譜形式打印出來，以便研究人員分析。

(資料圖片)

3、擴(kuò)展資料：高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

4、①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

5、②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。

6、③高效：分離效能高。

7、可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

8、④高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級。

9、⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

10、⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

11、此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。

12、高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。

13、在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。

14、高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

15、HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常?。◣爪蘭到幾十μm)，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時。

16、為了達(dá)到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。

17、為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。

18、高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。

19、HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a. 流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為1~10 mL/min)；b. 能抗溶劑腐蝕；c. 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×10^5Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達(dá)到150~300×10^5Pa。

20、⑴往復(fù)式柱塞泵當(dāng)柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時就輸出少量的流體。

21、反之，當(dāng)柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關(guān)閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。

22、這種泵的特點(diǎn)是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相。

23、⑵氣動放大泵其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（ SA ）活塞A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。

24、壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。

25、這是一種恒壓泵。

26、參考資料：百度百科——高效液相色譜高效液相層析儀根據(jù)各種各樣的化工互作用力來分離混合物。

27、這種互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質(zhì)。

28、使用高效液相色譜時，液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物中不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表一個另外化合物的種類，最后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質(zhì)。

29、以液體為流動相而設(shè)計(jì)的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。

30、采用高壓輸液泵，高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。

31、高效液相色譜儀種類繁多，但不論何種類型的高效液相色譜儀，基本上都分為4個部分：高壓輸液裝置，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。

32、拓展資料：高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中，常用于醫(yī)藥品、化學(xué)、環(huán)保、生命科學(xué)、與食品工業(yè)的研究上。

33、高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。

34、適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。

35、例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。

36、（通常用的最多的是第二種，即分配平衡，）色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

37、 1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。

38、分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。

39、常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。

40、適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。

41、常用于分離同分異構(gòu)體。

42、 2．液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。

43、分離過程是一個分配平衡過程。

44、 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。

45、由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。

46、現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

47、 液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

48、 正相色譜法 采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。

49、常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

50、 反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。

51、適用于分離非極性和極性較弱的化合物。

52、RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。

53、 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。

54、為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。

55、但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。

56、有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

57、 正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高～中 中～低 流動相極性 低～中 中～高 組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出 從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。

58、 3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。

59、被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。

60、 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。

61、被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強(qiáng)度影響。

62、pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。

63、流動相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。

64、 離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

65、 4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。

66、它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。

67、主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

68、 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。

69、另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。

70、 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

71、 離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。

72、被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。

73、 5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。

74、小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。

75、它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。

76、常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

77、簡單的說，就是樣品溶解在流動相中，隨流動相進(jìn)入色譜柱，經(jīng)過固定相（填料）時，會受到固定相的吸附。

78、樣品中不同組分受到的吸附不同，于是流出色譜柱的時間順序就不同。

79、如果是反相色譜，固定相（硅膠烷烴填料)極性 小于 流動相(乙腈、甲醇等溶液）。

80、樣品中的各組分，極性小的受到的固定相吸附力就比較大，較晚流出色譜柱，體現(xiàn)在譜圖中及出峰較晚。

81、正相色譜則相反。

82、HPLC是高壓輸送流動相，快速、高效分離的液相色譜法。

83、更詳細(xì)的資料，推薦你上儀器信息網(wǎng)等相關(guān)論壇，可以學(xué)習(xí)到很多東西。

本文到此分享完畢，希望對大家有所幫助。